Recherche (Inserm U844)

Physiopathologie des maladies auto-inflammatoires
FMF
TRAPS
Behçet

Mises au point et transferts de nouveaux outils diagnostiques et pronostiques
Mises au point de nouveaux outils diagnostiques
Nouveaux gènes et gènes candidats
Signature des fièvres récurrentes héréditaires
Pharmacogénétiques des arthrites chroniques

Physiopathologie des maladies auto-inflammatoires

FMF

La fièvre méditerranéenne familiale (FMF) est une maladie auto-inflammatoire de transmission autosomique récessive extrêmement fréquente dans certaines populations du contour méditerranéen. Le diagnostic génétique s'est développé depuis la découverte du gène en cause, MEFV en 1997 par notre consortium Pub. Ce gène exprimé principalement dans les leucocytes, code la protéine Marenostrine/Pyrine (M/P). La colchicine reste le traitement le plus efficace, bien que, d’une façon inexpliquée, environ 5 à 10 % des patients ne répondent pas à ce traitement.
          La nature inflammatoire de la FMF laisse penser que M/P agit comme un régulateur de la réponse inflammatoire. Cependant, la nature de la ou les voie(s) de régulation et l'identité des facteurs déclenchant les attaques chez des patients atteints de FMF, ne sont pas encore définies. Une des principales caractéristiques des attaques inflammatoires observées chez des patients atteints de FMF est l’influx massif de neutrophiles aux sites inflammatoires. La mort cellulaire programmée ou apoptose est augmentée dans les monocytes et neutrophiles après induction par une molécule de reconnaissance de la bactérie E. coli, alors que la phagocytose par des monocytes de patients est diminuée.

1. Résultats antérieurs

Nos efforts jusqu’en 2002 nous ont permis d’identifier le gène de la FMF (MEFV) dans le cadre d’un consortium Pub, de définir des corrélations génotype-phénotype Pub, d’évaluer les facteurs de risque pour l'amylose rénale Pub et de mettre en évidence MICA le premier locus modificateur Pub. Très vite, des similitudes sont apparues avec les patients souffrant de maladie de Behçet et nous avons émis l’hypothèse confirmée ensuite par d’autres, que MEFV est un facteur de susceptibilité pour Behçet Pub et de sévérité pour Crohn Pub.
               Nous avons étudié l’expression au niveau ARNm du gène MEFV et de certaines cytokines chez des patients atteints de FMF. Nous avons montré une diminution du taux d’expression de MEFV Pub et une augmentation des cytokines IL-6 et IL-8 chez les patients Pub

2. Résultats récents

Etude de la région promotrice du gène Pub
               Nous avons recherché des variants de séquences dans la région 5’UTR du gène MEFV chez des patients atteints de FMF qui ne présentaient aucune mutation de la séquence codante. Nous avons trouvés 6 nouveaux variants de séquences dans une région localisée à 825 pb en amont de l’ATG. Afin d’étudier le rôle de ces variants de séquence sur l’expression du gène MEFV, nous avons dans un premier temps caractérisé le promoteur et ainsi déterminé que la région localisée entre les nucléotides -949 et -152 du codon initiateur était importante pour la régulation de l’expression. Nous avons identifié une région activatrice localisée entre les nucléotides -571 et -414. L’activité du promoteur par des tests in vitro contenant 2 de ces 6 variants (c-614C>G et c-381C>T) diminue de 70 à 100 % respectivement, comparé à la séquence normale.

Analyse de la régulation post-transcriptionnelle
               Pour examiner l’épissage de MEFV, nous avons analysés par RT-PCR les mRNAs provenant de leucocytes de sang de 60 patients et de 34 individus. Nous avons ainsi identifié 5 nouveaux variants d’épissage alternatifs. Leur expression chez les patients et les contrôles n’est pas en faveur d’un effet pathogène sévère. Néanmoins, ces résultats suggèrent que la régulation de l’expression de MEFV est complexe.
               Puisque l’épissage alternatif et le mécanisme de nonsense-mediated decay (NMD) sont couramment couplés dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, nous avons analysé l’effet de l’inhibition indirecte et directe du NMD sur l’expression de différents transcrits du gène dans les monocytes et neutrophiles ainsi que dans la lignée cellulaire THP1 Pub. Nous montrons que le gène MEFV est le premier gène auto-inflammatoire régulé par le NMD d’une manière cellule- et transcrit-spécifique. Cette étude et nos premières analyses par western-blot, suggèrent que l’épissage alternatif de MEFV permet la traduction de plusieurs variants de P/M, ce qui pourrait expliquer les controverses sur sa fonction dans l’inflammation. Par ailleurs, nos résultats introduisent une nouvelle hypothèse que la variation de l’efficacité du NMD pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de la FMF comme modificateur phénotypique

3. Questions abordées dans notre laboratoire

Le but des projets de recherche est de déterminer l’implication de la protéine Marenostrine/Pyrine et l’effet de la colchicine dans les étapes de l’inflammation effectuées par le monocyte/macrophage et le neutrophile.

            (1) Quel est le rôle de M/P dans le chimiotactisme ?
            (2) Quel est le rôle de M/P dans la résolution de l’inflammation ?

Contact : Isabelle Touitou ou Sylvie Grandemange

TRAPS

TRAPS (TNFR-Associated Periodic Syndrome) est une maladie auto-inflammatoire de transmission autosomique dominante. Elle apparaît dans la petite enfance. La prise de glucocorticoïdes reste le traitement le plus efficace dans cette maladie même si certains patients ne répondent peu ou mal au traitement. Les avancées sur la physiopathologie de la maladie ont permis d’envisager de nouvelles thérapeutiques qui sont à ce jour à l’étude comme par exemple les anti-TNF et les anti-IL1.
          Le gène en cause TNFRSF1A code le récepteur au TNFa (TNFR1 ou p55). La liaison de TNFa au TNFR1 active soit le facteur de transcription  NF-kB qui à son tour, va induire l’expression de cytokine pro-inflammatoire, et l’apoptose via la caspase 8.
Plusieurs hypothèses ont été suggérées pour expliquer la maladie de TRAPS, soit un défaut : de clivage du récepteur, de son transport du reticulum endoplasmique à la membrane, de l’activation de NF-kB, ou de l’apoptose. Cependant, aucune corrélation claire phénotype-génotype n'a été tracée.
Notre équipe coordonne un consortium européen (FP7) EuroTRAPS qui est consacré à cette maladie.

1. Résultats récents

Au cours d’une étude de l’épissage du gène TNFRSF1A chez des individus contrôles et patients, nous avons identifié un nouveau transcrit d’épissage, TNFR1-d2 caractérisé par un épissage de l’exon 2 du gène. Ce transcrit présente une expression tissus spécifiques alors que celle du transcrit TNFR1 est ubiquitaire.

2. Questions abordées dans notre laboratoire

Le but des projets de recherche est de déterminer la fonction de TNFR1-d2 et son implication dans la physiopathologie de TRAPS.

            (1) Comment est régulé l’expression de TNFR1-d2 ?
            (2) Quel est la fonction de TNFR1-d2 ?

Contact : Isabelle Touitou ou Sylvie Grandemange

Behçet

La maladie auto-inflammatoire de Behçet (MB) est un désordre chronique multifactoriel. C’est une vascularite multisystémique d’origine inconnue. Elle a été principalement décrite chez le jeune enfant avec une prédisposition ethnique : pourtour méditerranéen, moyen Orient, Japon. A cause de la spécificité de la population atteinte, l’existence de cas familiaux et la forte association avec HLAB51, il est considéré que la MB peut avoir une composante génétique. La MB est difficile à reconnaître et son diagnostic ne repose que sur des critères cliniques définis en 1990. Son pronostic est grave, tant sur le plan fonctionnel (cécité, encéphalopathie) que sur le plan vital (thromboses, ruptures d’anévrismes).

1. Résultats antérieurs

Nous et d’autres groupes avons montré que des mutations dans les gènes MEFV et TNFRSF1 sont plus fréquentes dans la MB Pub. Nous avons criblé 3 autres gènes auto-inflammatoires (MVK, PSTPIP1, et LPIN2) chez 97 patients MB and 51 contrôles afin de voir s’ils pouvaient être des facteurs de susceptibilité supplémentaires pour la MB. Cette étude n’a pas mis en évidence une augmentation significative de mutations chez les patients comparés aux contrôles. Pub
               Par ailleurs, nous avons montré une augmentation de la récurrence familiale chez les patients. Cette augmentation est plus importante chez les cas pédiatriques que chez les adultes. Nous avons ensuite découvert une composante mendélienne à transmission récessive dans le groupe pédiatrique Pub.

2. Questions abordées dans notre laboratoire

Le but des projets de recherche est d’identifier le gène putatif chez les patients MB pédiatrique

Contact : Isabelle Touitou ou Mouna Barat

Mises au point et transferts de nouveaux outils diagnostiques et pronostiques

Mises au point de nouveaux outils diagnostiques

Les connexions entre toutes les maladies auto-inflammatoires d’un point de vue clinique mais aussi génétique étant de plus en plus étroites, il nous parait indispensable d’améliorer les techniques de criblage de variants de séquences.

Dans ce but, nous avons mis au point la technique de la courbe de fusion haute résolution (high resolution melting curves, HRM) et l’analyse quantitative afin d’identifier d’éventuel grand remaniement chromosomique (copy number variants, CNV). Nous avons criblés 10 gènes auto-inflammatoirs et trouvé plusieurs nouvelles mutations ponctuelles mais aucun réarrangement génique Pub.

Un nombre important de méthodes de génotypage a été développé. Nous avons recherché une approche fiable et rapidement accessible dans notre laboratoire pour le criblage haut débit de polymorphismes (single nucleotide polymorphism, SNP). Nous avons mis au point les techniques suivantes : TPAP (tetra primer amplification refractory mutation system PCR), UPMA (unlabeled probe melting analysis) et TaqMan SNP genotyping assay.

Contact : Isabelle Touitou ou Laurent Philibert ou Nathalie Pallares-Ruiz

Nouveaux gènes et gènes candidats

1. Résultats récents

NLRP7 (Nucleotide-binding domain, leucine-rich repeat family, pyrin domain containing 7) est apparenté à NLRP3 and NLRP12, 2 gènes responsables de fièvre récurrentes héréditaires. NLRP7 a récemment été associé à la maladie rare et héréditaire des échecs de la reproduction (RHM, recurrent hydatidiform moles). Nous avons mis en place le diagnostic de ce gène dans notre laboratoire, et trouvé plusieurs nouvelles mutations Pub.

2. Questions abordées dans notre laboratoire

            (1) Quels gènes candidats sont responsables de la RHM chez des femmes négatives pour NLRP7 ?
            (2) Quels gènes inflammatoires candidats sont responsables de maladies auto-inflammatoires héréditaires chez des patients dont le diagnostic génétique n’a pas été confirmé ?

Contact : Isabelle Touitou ou Laurent Philibert ou Cécile Rittore

Signature des fièvres récurrentes héréditaires

Bien que les 4 principales fièvres récurrentes (FMF, TRAPS, CAPS et MKD) soient génétiquement différentes, d’un point de vue clinique ces 4 entités possèdent des points communs. Chacune montrant une hétérogénéité tant en termes phénotypique que génétique (absence de mutation malgré des signes cliniques spécifiques), il est parfois difficile de poser un diagnostic précis dont dépend une thérapeutique ciblée efficace. Il nous a donc paru important d’analyser d’autres voies nous permettant d’aider à la classification de ces maladies.

Le but des projets de recherche est de définir une signature moléculaire spécifique des fièvres récurrentes héréditaires.

Contact : Isabelle Touitou ou Sylvie Grandemange

Pharmacogénétique des arthrites chroniques

La découverte des voies de signalisation défectueuses dans les maladies auto-inflammatoires a incité les cliniciens à examiner de nouvelles bio-thérapies comme les anti-TNF et anti-IL-1. Elles sont efficaces chez la plupart des patients, mais certains d'entre eux restent réfractaires au traitement ou même développent des effets secondaires.

Le but des projets de recherche est d’identifier une signature génétique de la réponse au traitement dans l’arthrite juvénile et rhumatoïde et dans TRAPS par l’analyse de l’impact combiné de 40 polymorphismes candidats.

Contact : Isabelle Touitou ou Cécile Rittore